Chromatografia

Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą rozdzielanie mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź ich grupy (frakcje), dzięki różnicom w zachowaniu się tych składników w układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna), druga zaś porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający).

Podział chromatografii zależnie od dominującego mechanizmu procesu rozdziału:

a. adsorpcyjna - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a nieruchomą ciało stałe o właściwościach adsorbujących i odpowiednim rozdrobnieniu (np. żel krzemionkowy, tlenek glinowy, węgiel aktywny itp.). Rozdział jest powodowany różnicami współczynników adsorpcji.

b. podziałowa - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a stacjonarną  ciecz zatrzymana na odpowiednim nośniku (bibuła, ziemia okrzemkowa, kulki szklane itp.). Rozdział jest wynikiem różnic współczynników podziału.

c. jonowymienna - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a stacjonarną wymieniacz jonowy. Rozdział zależy od różnic w sile wiązania składników przez wymieniacz.

d. żelowa - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a nieruchomą granulowany, jednorodny spęczniały żel. Rozdział jest powodowany różnicami w zdolnościach dyfundowania do cząsteczek żelu, a więc różnicami w wielkości cząsteczek składników.

Podział chromatografii w zależności od sposobu przeprowadzania rozdziału:

a) bibułowa (PC) której fazą nieruchomą jest odpowiednio przygotowana (np. zaimpregnowana ) specjalna bibuła chromatograficzna pocięta na arkusze, paski  lub krążki. W pobliżu krawędzi arkusza bądź paska lub środka krążka nanosi się na tzw. punkt startowy (krople badanego roztworu), a następnie powoduje się przepływ fazy ruchomej, co prowadzi do rozdzielenia składników mieszaniny (tzw. rozwijanie chromatogramu). Proces odbywa się w odpowiednim szczelnym naczyniu tzw. komorze chromatograficznej. Po zakończeniu rozwijania otrzymuje się plamy (lub pasma) chromatograficzne poszczególnych składników (lub frakcji), które uwidacznia się, np. przez przeprowadzenie reakcji barwnych (tzw. wywoływanie chromatogramu), obserwację w świetle nadfioletowym itp. Przez porównanie z analogicznie wykonanym chromatogramem mieszaniny substancji wzorcowych identyfikuje się poszczególne składniki, a przez porównanie wielkości intensywności plam uzyskuje się wyniki ilościowe.

b. cienkowarstwowa(TLC) - w której fazę nieruchomą nanosi się w postaci cienkiej równomiernej warstewki na płytkę szklaną, arkusik folii aluminiowej czy tworzywa sztucznego. Dalsze postępowanie jest podobne jak w chromatografii bibułowej

c. kolumnowa - kolumnę (najczęściej szklaną) wypełnia się fazą nieruchomą (adsorbentem, nośnikiem nasyconym ciekłą fazą nieruchomą, jonitem, granulowanym żelem) i na jej szczyt wprowadza badany roztwór, a następnie fazę ruchomą (eluent). Zachodzi rozdzielanie składników, które bądź pozostają w kolumnie (tworząc oddzielne pasma) lub są kolejno wymywane (elucja). W poszczególnych porcjach wycieku (eluatu) przeprowadza się oznaczenia rozdzielanych składników, np. przez miareczkowanie, pomiar refrakcji itd.

d. gazowa - w której fazą ruchomą jest gaz, a faza nieruchoma jest umieszczona w kolumnie. Próbkę (gaz, ciecz) wstrzykuje się przed kolumną do strumienia przepływającego z określoną prędkością i pod określonym ciśnieniem gazu nośnego. Za kolumną znajduje się detektor czuły na zmiany składu gazu, którego sygnały są zapisywane w postaci chromatogramu. Chromatografię gazową wykonuje się w chromatografach gazowych wyposażonych w urządzenia sterujące przepływem gazów, temperaturą pracy, różnego typu detektory itp. W ustalonych warunkach pracy czas wyjścia składnika z kolumny umożliwia jego identyfikację, a powierzchnia piku jest proporcjonalna do jego zawartości. Chromatografia gazowa jest stosowana powszechnie do celów analitycznych (chromatografia gazowa analityczna); do otrzymywania czystych substancji (chromatografia gazowa preparatywna) oraz w badaniach fizykochemicznych.

e. cieczowa - w której fazą ruchomą jest ciecz przepływająca przez kolumnę sposób ciągły i pod ciśnieniem do kilkudziesięciu MPa. Wykonuje się ją w chromatografach cieczowych działających podobnie jak chromatograf gazowy. Oznaczenie całkowitego stężenia soli stanowi ważną dziedzinę zastosowania metody jonitowej. Roztwór analizowany przepuszcza się przez kolumnę kationitową i po przemyciu wodą destylowaną otrzymany roztwór miareczkuje się mianowanym roztworem ługu sodowego. Ponieważ w roztworze oznaczanym mogą znajdować się kwasy należy uwzględnić to podczas wykonywania analizy. W celu oznaczenia całkowitej zawartości soli w roztworze za pomocą miareczkowania uwolnionego kwasu, należy odjąć od wartości otrzymanej z miareczkowania wycieku tę ilość kwasu, która istnieje w roztworze pierwotnym (H2SO4 ,H2CO3 ,H3PO4 ) lub w analizie zamienić różne sole w chlorki, przed przystąpieniem do oznaczania poprzez gotowanie próbki z kwasem solnym (ok. 30 minut).

Wiadomości ogólne: dotyczące chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej

Podstawą działania chromatografii bibułowej (PC) jest podział substancji rozdzielanych miedzy fazę nieruchomą, którą stanowi woda unieruchomiona przez celulozę dzięki jej higroskopijności, oraz fazę ruchomą rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę rozpuszczalników, często nawet z wodą, wędrujące po bibule dzięki siłom kapilarnym. Celuloza stanowiąca nośnik dla fazy stacjonarnej (wody) ma niewielkie właściwości adsorpcyjne i prawie nie zniekształca przebiegu rozdzielania opartego na podziale substancji między wodę a wędrujący rozpuszczalnik. Jeżeli współczynniki podziału substancji naniesionych na bibułę są różne, to w trakcie wędrówki po bibule następuje ich rozdzielenie

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest również odmianą chromatografii podziałowej. Fazę nieruchomą stanowi woda zatrzymana w cienkiej warstwie sorbenta typu krzemionki lub tlenku glinu, naniesionej na płytkę szklaną. Fazą ruchomą jest rozpuszczalnik wędrujący przez tę warstewkę na zasadzie sił kapilarnych. Substancje rozdzielane, naniesione na płytkę, po której następnie posuwa się rozpuszczalnik, rozdzielają się na zasadzie podziału między fazę nieruchomą na sorbencie a fazę rozpuszczalnika. Gdy ich współczynniki podziału są różne, następuje rozdzielenie. Wielkością charakteryzującą substancję w określonym układzie chromatografii bibułowej lub chromatografii cienkowarstwowej jest wielkość Rf (współczynnik retencji) zdefiniowana jako stosunek drogi, którą od punktu startowego na bibule lub płytce przebyła dana substancja Ds do drogi, którą w tym samym czasie przebył rozpuszczalnik (Dr):

Rf = Ds/Dr

Czasami stosuje się również wielkość Rs, definiowaną jako stosunek drogi, którą od punktu startowego na bibule lub płytce przebyła substancja, (Ds), do drogi, którą w tym samym czasie przebyła wybrana przez nas substancja wzorcowa, (Dw)

Rs = Ds/Dw

W przypadku wielkości Rs, podaje się zawsze nazwę wzorca, np. glicyna. Zarówno Rf jak i Rs są wielkościami, które charakteryzują liczbowo substancje w danym określonym układzie. Nie są to wielkości dobrze powtarzalne.

Zależą, bowiem bardzo od drobnych nawet różnic w sposobie wykonania chromatogramu, stąd mimo opublikowania wielkiej liczby danych na ten temat nie jest wskazane identyfikowanie danej substancji na podstawie jej literaturowej wartości Rf bez próby porównawczej ze znaną substancją wzorcową.

Technika wykonania i aparatura

Przebieg wykonania chromatogramu PC lub TLC jest następujący. Na pasek bibuły chromatograficznej lub płytkę TLC nanosi się z brzegu niewielką ilość roztworu badanej mieszaniny i czeka się, aż plamka wyschnie. Następnie bibułę lub płytkę umieszcza się w komorze chromatograficznej i zanurza skraj bibuły lub płytki w rozpuszczalniku. Rozpuszczalnik wędruje do góry bibuły względnie płytki. Kiedy osiągnie drugi koniec, wyjmuje się bibułę (płytkę) z komory i suszy. Jeżeli substancje są barwne, obserwuje się od razu rozdzielone plamki poszczególnych substancji. Plamy substancji fluoryzujących można obserwować po naświetleniu promieniowaniem UV. W przypadku substancji bezbarwnych wywołuje się chromatogram spryskując bibułę (płytkę) odpowiednim odczynnikiem dającym reakcje barwne z rozdzielanymi substancjami. Omówimy kolejno niezbędne wyposażenie i warunki wykonania obydwu metod. Fazę nieruchomą w przypadku chromatografii bibułowej stanowi specjalna bibuła produkowana do tych celów. Powszechnie stosowana jest bibuła firmy Whatman, której Nr l ma mniejszą pojemność, a Nr 3 większą. Do rozdzielenia jednej próbki używa się paska o wymiarach ok. 3-5 cm szerokości i 30 cm długości. W przypadku jednoczesnego rozdzielania kilku próbek pasek musi być odpowiednio szerszy. Bibułę przed procesem chromatograficznym kondycjonuje się, tj. nasyca parami mieszaniny rozpuszczalników, używanych następnie do wymywania. W tym celu zamyka się bibułę w eksykatorze lub w komorze chromatograficznej nad otwartymi naczyńkami z mieszaniną rozpuszczalników. Fazę nieruchomą w przypadku chromatografii cienkowarstwowej stanowią płytki szklane (bywają też metalowe lub z tworzyw sztucznych) o wymiarach 5 x 20,10 x 20 lub 20 x 20 cm, pokryte warstwą adsorbent. Jako adsorbenty stosuje się: żel krzemionkowy, tlenek glinu, ziemię okrzemkową, proszek celulozowy, proszek poliamidowy i inne. Najczęściej jednak używa się żelu krzemionkowego, który jest najbardziej uniwersalny. Płytki do TLC są produkowane z gotową warstwą adsorpcyjną. Można je też przygotowywać w laboratorium. Wymaga to jednak dość dużej wprawy, aby otrzymać równej grubości jednolitą warstwę, nawet, jeśli stosuje się produkowane w tym celu specjalne urządzenia. Roztwór próbki w lotnym rozpuszczalniku w ilości zwykle nie większej niż 20 ul nanosi się porcjami po 5 ul (susząc po każdej porcji) na tzw. punkt startowy, położony 15 mm od podstawy i 15 mm od boku bibuły lub płytki. Gdy nanosi się więcej próbek lub próbkę i wzorzec, to odległość między punktami startowymi powinna wynosić nie mniej jak 20 mm. Po naniesieniu i wyschnięciu próbek umieszcza się bibułę (płytkę) w komorze chromatograficznej. W przypadku chromatografii bibułowej tak przygotowaną bibułę poddaje się rozwinięciu chromatogramu, tj. wprowadza się na nią fazę ruchomą. Operację tę możną wykonać metodą wstępującą lub zstępującą. Metoda wstępująca polega na zawieszeniu arkusza bibuły w komorze chromatograficznej, punktami startowymi do dołu, i zanurzeniu dolnej jego krawędzi w zbiorniku z fazą ruchomą, która siłami kapilarnymi jest wciągana do góry arkusza. Wygodny sposób, pokazany na rys a i b, polega na zwinięciu arkusza w rulon i wstawieniu go do naczynia z eluentem. W metodzie zstępującej arkusz zanurzony jest górną krawędzią w naczyniu, z eluentem i rozpuszczalnik (eluent) spływa po nim w dół. Na rysunku przedstawione są komory stosowane w metodzie wstępującej (a) i zstępującej (b).Rozwijanie chromatogramu jest ukończone, gdy rozpuszczalnik osiągnie przeciwległy koniec bibuły. Jeżeli rozdzielane substancje są barwne, to chromatogram jest od razu gotowy, bowiem widzimy oddzielone od siebie plamy poszczególnych składników. Jeżeli substancje są bezbarwne, to należy chromatogram wywołać. W tym celu po wysuszeniu skrapia się go z rozpylacza roztworem odczynnika lub zanurza do takiego roztworu i ponownie suszy przypadku płytek TLC wstawia się je do podobnych komór w kształcie graniastosłupa, na których dnie znajduje się naczynie z 5 mm warstwą rozpuszczalnika. W chromatografii cienkowarstwowej stosuje się tylko metodę wstępującą. Po osiągnięciu przez rozpuszczalnik poziomu ok. 5 mm poniżej górnego skraju płytki, wyjmuje się płytkę, suszy w przypadku substancji bezbarwnych wywołuje plamki rozpylając na płytkę odpowiedni odczynnik. Zarówno w przypadku chromatografii PC jak i TLC należy przestrzegać identycznego wykonywania wszystkich czynności. W szczególności ważne jest zachowywanie zawsze jednakowego czasu nasycania komór rozpuszczalnikiem przed włożeniem do nich bibuły lub płytki. Atmosfera panująca w komorze ma znaczny wpływ na rozwijanie chromatogramu i powtarzalne wyniki można otrzymać tylko przy zachowaniu ściśle tych samych warunków wykonania. Najistotniejszym czynnikiem wpływającym na wyniki w przypadku chromatografii bibułowej jest dobór rozpuszczalnika, a w przypadku chromatografii cienkowarstwowej dobór adsorbenta. i rozpuszczalnika. Nie ma ściśle sprecyzowanych zasad dokonywania tego wyboru, można tylko przytoczyć ogólne przesłanki. W przypadku rozdzielania związków bardziej polarnych lub związków mało różniących się między sobą polarnością lepiej jest korzystać z chromatografii podziałowej, a więc stosować chromatografię bibułową, a w przypadku cienkowarstwowej korzystać ze słabo adsorbującej warstwy, np. warstwy celulozowej. Przy rozdzielaniu związków słabo polarnych i związków różniących się znacznie polarnością należy wybrać chromatografię cienkowarstwową z dość silnym adsorbentem, np. żelem krzemionkowym.

Pewną orientację w stosowaniu adsorbentów w chromatografii cienkowarstwowej może dać następująca klasyfikacja adsorbentów:

a) tlenek glinu-rozdzielanie zasad i steroidów,

b) ziemia okrzemkowa-cukry,

c) żel krzemionkowy-wszystkie klasy związków (zależnie od przygotowania żelu),

d)celuloza- związki polarne (także aminokwasy i nukleotydy),

e) poliamidy, antocyjaniny, flawony,

f) pochodne dwu- i trójetyloaminocelulozy oraz karboksymetylocelulozy barwniki, nukleotydy, fosfolipidy, glikolipidy.

Dobierając rozpuszczalnik trzeba kierować się jego polarnością, której najlepszym liczbowym wyrazem jest stała dielektryczna. Zwykle najlepsze działanie wykazują mieszaniny 2-3 rozpuszczalników. W literaturze można znaleźć dane dotyczące układów rozdzielania metodami PC i TLC oraz gotowe informacje i konkretne przesłanki do zaprojektowania układu dla określonego zadania.

Wywoływanie plam na chromatogramach

-Wywoływanie metodami fizycznymi

Wiele rozdzielanych substancji fluoryzuje w świetle lampy kwarcowej lub absorbuje promieniowanie nadfioletowe. Dla utrwalenia obrazu chromatogramów obrysowuje się plamy ołówkiem lub stosuje fotografowanie z użyciem odpowiednich filtrów i błon fotograficznych. Do oceny chromatografii bibułowej najdogodniejsza jest lampa kwarcowa z filtrem Wooda. Świecące plamy udaje się odróżnić i zidentyfikować nie tylko na podstawie ich położenia, lecz również na podstawie swoistego zabarwienia.

-Wywoływanie metodami chemicznymi.

Bezbarwne rozdzielone substancje uwidocznia się na chromatogramie za pomocą odpowiednich odczynników chemicznych. Istnieją dwa sposoby wywoływania plam na bibule: przez zanurzanie bibuły we właściwym odczynniku wywołującym, gdy substancje są nierozpuszczalne, i przez rozpylanie na bibule cienkiej mgiełki odczynnika wywołującego, gdy substancje są rozpuszczalne i nie są adsorbowane przez bibułę. O dobrym wywoływaniu decyduje niewątpliwie jakość rozpylacza. Jeżeli reakcja badanych substancji z odczynnikiem wywołującym zachodzi w wyższej temperaturze, to ogrzewa się chromatogramy w suszarce do wymaganej temperatury. Szklane drzwiczki w suszarce ułatwiają obserwację występowania kolejnych plam i barw pośrednich

-Wywoływanie metodami biologicznymi

Biologiczne metody wywoływania chromatogramów mają zastosowanie w badaniach substancji czynnych, występujących w żywych ustrojach, np. enzymów, koenzymów, aktywatorów i inhibitorów enzymatycznych. Na przykład w badaniach przemian enzymatycznych nanosi się badany materiał na bibułę i rozpyla roztwór preparatu enzymatycznego. Inkubację przeprowadza się w termostacie w temp. 37-38°C. Po inkubacji, rozwinięciu chromatogramu i wywołaniu właściwym testem, identyfikuje się produkty reakcji enzymatycznej. Metoda ta służy do badania i rozdzielania enzymów, koenzymów, aktywatorów, inhibitorów, izomerów optycznych itp. Za pomocą testu wzorcowego udaje się identyfikować substancje, które przyspieszają lub hamują wzrost bakterii, drożdży i roślin.

-Wywoływanie wielokrotne

Czasem plamy wielokrotnie wywołuje się na tych samych chromatogramach przy sukcesywnym stosowaniu różnych odczynników wywołujących. Na przykład aminokwasy wywołuje się niekiedy sukcesywnie ninhydryną i izatyną. Przy wielokrotnym wywoływaniu udaje się wykryć obok siebie różnego typu substancje, jak np. aminokwasy, kwasy organiczne i węglowodany.

Suszenie chromatogramów

Temperaturę suszenia "dostosowuje się do rodzaju analizowanych substancji i do zastosowanych układów rozpuszczalników. Rozpuszczalniki o niższej temperaturze wrzenia udaje się usunąć z bibuły przez suszenie nawet w temperaturze pokojowej w ciągu kilku godzin (w ten sposób usuwa się propanol i butanol). Rozpuszczalniki o wyższej temperaturze wrzenia, np. fenol, oktanol, usuwa się z bibuły przez suszenie w termostacie w ciągu kilkunastu godzin w temp. 60-120°C. W celu szybszego usunięcia z termostatu par rozpuszczalnika stosuje się przewietrzanie termostatu, ssanie powietrza lub oba sposoby równocześnie. Do zawieszania chromatogramów używa się różnego typu klamer.

Utrwalanie chromatogramów

W celu zachowania chromatogramów do dokumentacji naukowej i zabezpieczenia przed wpływem światła i powietrza stosuje się lakierowanie lub parafinowanie lub sporządza się ich fotografie.

Chromatografia kolumnowa

Technika chromatografii kolumnowej znajduje zastosowanie w chromatografii: adsorpcyjnej, podziałowej i jonowymiennej. Ze względu na zakres pracy dyplomowej omówiona będzie technika chromatografii adsorpcyjnej kolumnowej. Kolumna chromatograficzna i jej napełnianie. Jako kolumny chromatograficzne stosuje się zwykle rurki szklane o długości i średnicy ściśle określonej dla danego nośnika i badanej substancji (dł. od 15 cm do kilku metrów i szer. od 0.2 cm do kilkudziesięciu cm); wyciągnięte z jednego końca i zaopatrzone powyżej tego końca doszlifowany korek szklany oraz porowatą płytką szklaną. Właściwą kolumnę stanowi złoże nośnika i badanej substancji, na którym zachodzi proces chromatograficzny. Dolny otwór kolumny zamyka się watą i następnie napełnia ją przesianym adsorbentem. Wsypuje się go stopniowo, lekko ugniata pręcikiem szklanym. Należy go równomiernie rozmieścić w kolumnie, aby uniknąć powstania nieregularnych pasm pęcherzyków powietrza. Ilość adsorbenta powinna być 30-krotnie większa od masy zaadsorbowanej substancji. Złoże można przykryć od góry dobrze dopasowanym krążkiem bibuły filtracyjnej; ułatwia to wprowadzenie badanego roztworu i rozpuszczalnika bez deformowania górnej warstwy złoża. W celu uniknięcia strat można także od dołu kolumnę przykryć krążkiem bibuły. Oprócz napełnienia kolumny suchym nośnikiem można napełnić ją także nośnikiem mokrym. W tym celu rozciera się adsorbent z rozpuszczalnikiem na papkę, po czym wlewa go małymi porcjami do kolumny. Gdy ciecz odcieknie wlewa się niezwłocznie nową porcję. Po odcieknięciu rozpuszczalnika adsorbent przykrywa się i zaczyna wkraplać roztwór badany

Wyodrębnienie związków

Po rozwinięciu chromatogramu zawartość kolumny wypycha się ostrożnie za pomocą drewnianego tłoczka na papier. Następnie poszczególne warstwy rozcina się nożem i zadaje odpowiednim rozpuszczalnikiem. Wyodrębnienie związku z kolumny chromatograficznej można przeprowadzić nie rozdzielając adsorbenta na warstwy. Przepuszcza się wówczas przez kolumnę rozpuszczalnik tak długo, aż poszczególne składniki zostaną całkowicie wypłukane. Odbywa się to stopniowo. Jeżeli więc wyciek będzie się zbierał w małych frakcjach, to uzyska się dość dokładne rozdzielenie składników.

Metody stosowane w chromatografii adsorbcyjnej kolumnowej

Każdy proces chromatograficzny można przeprowadzić za pomocą trzech zasadniczych metod, które różnicują się najwyraźniej na przykładzie adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej:

Metoda analizy czołowej

Roztwór badanej mieszaniny składników przesącza się w sposób ciągły przez kolumnę, którą uprzednio przemywa się czystym rozpuszczalnikiem, aż do całkowitego nasycenia powierzchni  adsorbentu. Podczas przepływu tego roztworu  przez kolumnę  adsorbentu następuje zróżnicowanie prędkości wędrowania poszczególnych składników. Składnik o najmniejszym powinowactwie do fazy nieruchomej ma największą prędkość wędrowania i stanowi pasmo pierwsze od dołu kolumny oraz jedyne, które uzyskane może być w całości w stanie czystym; wszystkie pasma znajdujące się ponad nim reprezentują mieszaninę od dwóch i więcej składników. Analiza czołowa umożliwia określenie, ile składników zawiera badana mieszanina oraz pozwala uzyskać w stanie czystym tylko składnik najsłabiej adsorbowany.

Metoda wypierania (rugowania)

Na wierzchołek kolumny chromatograficznej umieszcza się badaną mieszaninę w małej objętości roztworu. Następnie przez przemywanie kolumny roztworem zawierającym kilka składników o różnych właściwościach wypierających rozsuwa się od siebie pasma poszczególnych substancji. Metoda ta nadaje się tylko do rozdzielenia substancji wykazujących odwracalną adsorpcję oraz umożliwia jedynie półilościowe określenie zawartości poszczególnych składników w badanej mieszaninie

Metoda wymywania (elucyjna)

Przeprowadza się ją w dwóch etapach. W pierwszym etapie niewielką objętość roztworu badanej mieszaniny wprowadza się na wierzchołek kolumny (adsorpcja). W drugim etapie rozwija się chromatogram przez przemywanie kolumny czystym rozpuszczalnikiem lub serią rozpuszczalników o coraz większej mocy elucyjnej albo rozpuszczalnikiem z niewielką ilością substancji powierzchniowo czynnej (desorpcja). Substancja o większej zdolności adsorbowania się przesuwa wzdłuż kolumny wolniej od substancji słabiej adsorbowanej. Rozdział składników o dużych różnicach  szybkości wędrowania osiąga się na kolumnie krótszej, natomiast do składników o małych różnicach prędkości migracji należy stosować kolumnę dłuższą i zwiększoną ilość cieczy wymywającej. Kolejno w oddzielnych odbieralnikach zbiera się frakcje przesączu, z których każda zawiera jeden składnik badanej mieszaniny.

 Metoda elucyjna jest głównym sposobem przeprowadzenia  praktycznie każdej chromatografii oraz ma podstawowe znaczenie w tych procesach, ponieważ umożliwia rozdzielanie oraz ilościowe odzyskanie poszczególnych  składników dość złożonych mieszanin.

Zalety chromatografii adsorpcyjnej

Specyficzność - możliwość rozdziału składników zbliżonych pod względem składu chemicznego, nie dających rozdzielić się zwykłymi metodami krystalizacji lub destylacji frakcjonowanej.

Uniwersalność - nadawanie się do rozdziału substancji bardzo różnych, od węglowodorów niepolarnych lub słabo polarnych do zasad organicznych i kwasów silnie polarnych i reaktywnych.

Szerokie możliwości - zmiany warunków rozdziału chromatograficznego dzięki zmianie adsorbentu i solwentu.

Ograniczenia chromatografii adsorpcyjnej

 Znajduje zastosowanie tylko do rozdziału substancji o minimalnych różnicach struktury chemicznej, które pociągają za sobą różnice powinowactwa adsorpcyjnego. Składniki adsorbatu nie mogą reagować ze sobą ani z solwentem czy adsorbentem, również nie mogą być adsorbowane nieodwracalnie przez adsorbent